细胞凋亡，也被称为程序性细胞死亡，是维持生物体稳态及清除异常或多余细胞的重要生理机制。在生物医学研究中，准确检测与量化凋亡细胞是至关重要的。流式细胞术凭借其高通量、多参数和定量的优势，已经成为检测细胞凋亡的金标准方法。其中，最为常用和经典的技术是Annexin V结合/碘化丙啶（PI）双染法。

核心原理：

Annexin V：用于识别早期凋亡细胞。在凋亡早期，细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸（PS）会翻转至外侧，这是重要的“吃我”信号。Annexin V是一种依赖于钙离子的磷脂结合蛋白，能够特异性结合暴露在细胞膜外的PS，从而标记早期凋亡细胞。碘化丙啶（PI）：用于识别晚期凋亡和坏死细胞。PI是一种核酸染料，无法穿透完整的细胞膜。只有当细胞膜丧失完整性（晚期凋亡或坏死）时，PI才会进入细胞并与DNA/RNA结合，发出荧光。活细胞和早期凋亡细胞（膜完整）会拒染PI。通过同时检测Annexin V和PI的信号，可以将细胞群体精确地区分为四个类别：

• Annexin V⁻/PI⁺：坏死细胞（膜完整性丧失，但PS未外翻或已降解）
• Annexin V⁺/PI⁺：晚期凋亡细胞（膜PS外翻，膜完整性丧失）
• Annexin V⁻/PI⁻：活细胞（正常/未凋亡）
• Annexin V⁺/PI⁻：早期凋亡细胞（膜PS外翻，膜完整）

实验步骤：

以贴壁细胞为例，进行Annexin V/PI双染法的实验步骤如下：

• 细胞样本（处理组与对照组）
• 1x Annexin V结合缓冲液（通常由试剂盒提供或自制）
• FITC（或其他荧光素）标记的Annexin V
• 碘化丙啶（PI）溶液（工作浓度通常为1-5 μg/mL）
• PBS（无钙镁）
• 胰酶（不含EDTA或含低浓度EDTA）或细胞刮刀
• 流式管、离心机、冰、移液器及枪头

关键操作步骤：

细胞准备与处理：将细胞接种于培养板中，生长到合适的密度后施加凋亡诱导因素（如药物、射线等）。确保在处理结束时收集足够数量的细胞（通常≥10⁶个/样本）。

细胞收集：对于贴壁细胞，轻柔吸弃培养液，用预冷的PBS轻洗后，用适量的胰酶进行消化，并在细胞刚开始变圆松动时立即加入含血清的培养基终止消化。悬浮细胞则直接离心收集。

染色与检测：

将细胞重悬于1x Annexin V结合缓冲液中，加入FITC-Annexin V并避光孵育。随后加入PI溶液（可选，但强烈推荐双染）。在染色后1小时内完成流式检测，确保避光并设置合适的电压和补偿。

结果解读：

流式细胞仪分析软件（如FlowJo等）会生成双参数散点图，X轴代表Annexin V荧光强度，Y轴代表PI荧光强度。根据象限划分，左下象限（Q4）为活细胞，右下象限（Q3）为早期凋亡细胞，右上象限（Q2）为晚期凋亡或坏死细胞，左上象限（Q1）为坏死细胞或机械损伤细胞。

注意事项：

进行检测时，细胞样本最好在处理后<1小时内检测，且所有操作步骤均需轻柔，以避免细胞损伤。

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