在之前发布的文章中，我们已经了解到慢病毒能够高效地将外源基因整合到宿主的染色体上，从而实现在体内的长期表达。同时，慢病毒还具备感染几乎所有哺乳动物细胞、干细胞及原代细胞的能力，这些优点使其成为强大而有效的基因传递工具，广泛应用于生物医学研究和治疗。那么，当我们掌握了慢病毒的包装方法并获得了包装好的慢病毒后，接下来的操作该如何进行呢？今天，尊龙凯时将分享慢病毒使用后的详细操作步骤，内容非常丰富，敬请阅读！

1. 病毒的储存

包装好的慢病毒建议分装后置于-80℃冰箱保存，储存期限为半年。若超过半年，使用前建议重新测定病毒滴度。如果实验在短时间内（3-5天）进行，可以将其保存在4℃。使用病毒时，要尽量避免反复冻融，因为反复冻融会降低病毒滴度，建议根据每次实验用量进行分装。

2. 病毒的稀释

若需要稀释病毒，先将病毒在冰浴中融化，然后用PBS或不含血清的培养基进行稀释，并在4℃保存。为了保证病毒滴度，建议在3天内使用完毕。

3. 预实验摸索最佳MOI

不同细胞对慢病毒的敏感性不同，每种慢病毒载体的荧光强度也有差异，因此在正式实验前需要通过预实验来确定感染细胞的感染复数（MOI）和最佳感染条件。这包括接种的细胞数、总体积及换液时间等，以确保实验达到理想效果。

在预实验中，第一天将健康的目的细胞以1×10⁴个/孔接种于96孔板中，放入37℃、5% CO₂培养箱中培养过夜。第二天，根据需要设定MOI范围，一般为3-100。从-80℃冰箱取出的病毒在冰浴中融化后，按照预设的MOI值按需添加病毒原液。

将感染后培养液在16-24小时后更换为正常培养液，继续培养48-72小时后，使用倒置荧光显微镜观察并评估感染效率，以最终确定合适的MOI值用于正式实验。

4. 慢病毒感染目的细胞

当确定了MOI值后，可以进行正式感染实验。以带有GFP荧光标记和Puromycin抗性的慢病毒感染细胞为例，具体操作步骤如下：

第一天，按实验需要将细胞接种在24孔板中，细胞密度为5-10×10⁴ cells/孔，继续在37℃培养过夜。第二天，要从-80℃冰箱取出病毒冰浴融化，根据预实验的MOI值用新鲜完整培养基稀释病毒。吸走细胞原有培养基后，将病毒液加入细胞中，并依据预实验结果决定是否添加Polybrene。感染后，在37℃培养过夜。感染16-24小时后，更换为新鲜培养基，继续培养至检测目的蛋白的表达。

5. 目的细胞稳转株的构建

成功感染细胞后，带有不同抗性的慢病毒可使细胞在相应抗生素的选择中存活，而未感染的细胞则无法存活。通过这种抗性筛选，能够成功筛选出稳定表达目的基因的细胞株。以Puromycin抗性慢病毒感染后的细胞为例，感染48-72小时后，将细胞移至含合适浓度Puromycin的培养基中，每3-4天更换一次，直至未感染组细胞被抗生素杀灭，而感染组细胞保持存活。

在筛选过程中，将抗生素浓度降低至维持浓度，对感染后的细胞进行筛选和扩增，并收集细胞进行qPCR或Western Blot鉴定以确认基因的表达水平，并根据鉴定结果冻存细胞。

尊龙凯时的这些步骤和方法，可以为您在慢病毒实验中的操作提供有力支持，助力于您在生物医学研究中的成功实现。